【实验背景知识】
我们常说，细胞生物实验入门，过了养细胞的关卡，接下来就是MTT了。
所以，MTT是什么？MTT为黄色或橙黄色粉末状化学试剂，中文名噻唑蓝，其主要作用为检测细胞存活和生长。因此，其用途主要包括两方面：1.检测药物或其他干预方式对体外培养的细胞的细胞毒性测定；2.细胞增殖及活性测定。MTT的检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO )能溶解细胞中的甲瓒，用酶标仪在490nm或570nm波长处测定其光吸收值，在一定细胞数范围内，MTT结晶溶解所致的吸光度值与细胞数量成正比。根据测得的吸光度值(OD值)，来判断活细胞数量，OD值越大，细胞数量越多或活性越强(如果是测药物毒性，则表示药物毒性越小)。经验心得，MTT实验最终吸光度应当落于0.8~1.2左右，太小检测误差占的比例较多，太大吸收值可能已经超出线性范围。
因为MTT最终的量化形式为甲瓒结晶溶解测量吸光度，培养基的本底颜色将会对结果产生极大干扰，故最终测量前需要抽去培养液上清。因此，本实验主要适用于贴壁细胞，对于半贴壁或悬浮细胞相关实验，可考虑使用CCK8法。CCK8法详细教程，详见它文。
【实验所需的材料】
1.MTT溶液：
购买商品化MTT粉末，使用PBS或按照说明书要求，通常配置为5mg/ml终浓度的应用液。市售MTT粉末，一般包装为100mg、250mg或1g，个人建议对于价格昂贵的小包装药品，应当一次性配置成高浓度贮备液，避免多次使用天平称量分装。以100mg包装的粉末为例，100mg粉末应当溶解于20ml PBS中。
具体步骤如下：事先低速离心粉末包装，致粉末集中于包装瓶底部，移液枪精确吸取500~1000μl的PBS入含MTT粉末的小瓶，反复吹打若干次后，将液体转移至新的50ml离心管。移液枪头（后述为枪头A）不丢弃（枪头上沾有大量未溶解的MTT粉末），使用另一干净枪头（后述为枪头B）再次移液500~1000μl PBS至MTT瓶中（注意避免枪头B粘上MTT粉末或液体）。再使用枪头A反复吹打MTT瓶中液体，并转移液体至50ml离心管。重复数次，直至MTT瓶中不残留药品，向50ml离心管中补进PBS至终体积为20ml。使用枪头A反复吹打MTT悬液，至粉末完全溶解。MTT溶液转移至超净台内，使用0.22μm孔径的水相滤器过滤并分装。分装后的MTT溶液避光储存于-20℃。使用时，化开分装，化开后可临时避光储存于4℃，推荐化开后使用时间不超过一周。注意，MTT使用需要无菌操作。配制并过滤后的MTT呈淡黄色清亮液体，使用过程中若发现液体变色（常变为灰绿色）或装有MTT药品的离心管口散在分布蓝色斑点（药品污染），则建议丢弃。此外，MTT有强致癌性，使用时注意防护。事实上，能够作用于活细胞的各类化学试剂毒性都很剧烈，生物实验充满风险，同僚们一定提高警惕，注意防护。
2.DMSO：
DMSO，中文名为二甲基亚砜，是一种含硫有机化合物，常温下为无色透明液体，4℃即可冻结。DMSO被誉为“万能溶剂，具有高极性、高沸点、热稳定性好、非质子、与水混溶的特性，能溶于乙醇、丙醇、苯和氯仿等大多数有机物”。
3.其他准备物品
各个课题组的具体情况或许有所不同，但养成实验前一天检查实验用品、耗材的习惯强烈建议养成。本次实验，应当提前准备MTT应用液、常规细胞培养全套、实验干预相关药品、无菌离心管、无菌枪头、96孔板等，确认所需耗材与药品足量。
【MTT法 实验步骤】
1. 胰酶消化对数期细胞，血清中止消化，移液枪吹打至细胞悬浮，细胞悬液1000rpm离心5分钟，弃上清，重悬沉淀制成细胞悬液。细胞计数调整其浓度至5×104/ml（具体细胞密度根据需求适当调整）。细胞培养及技术方法详见公众号中其他相关文章。
2. 将细胞悬液制备好后，轻轻混匀，植入96孔板。推荐每个实验分组设一列（6个复孔），每孔加入100ul细胞悬液,即植入的细胞量为5000/孔。具体每孔植入的细胞数量通常为3000至8000，可设细胞梯度行预实验，取OD490与细胞数量成正相关的范围为佳。6*N个实验孔周围使用PBS封边，避免因实验时间较长，边缘的实验孔培养体系蒸发，引入不必要的干扰因素。
之所以认为MTT实验室细胞生物实验入门中的一项重要实验，是因为细胞悬液在植入96孔板的过程中，如果出现细胞消化不均一，细胞成团的现象，可能导致各分组实验孔内细胞数量不一致。若细胞悬液打入96孔板内出现涡流，则可能出现部分孔内细胞集中于孔周围，而中心空洞或稀疏的现象，同样的会影响最终实验结果。若操作不干脆或磨蹭，则后植入细胞的实验孔中细胞状态远不如最先植入的实验孔，同样的引入了不必要的干扰因素。再有，随着操作时间的推移，细胞悬液仍在不断沉降，因此接种过程应当反复多次轻柔混匀，以确保未因细胞沉降而接入细胞数量不均一的情况发生。综上，接种96孔板的影响因素甚多，为减少相关干扰因素带来的影响，推荐每列（6孔）设为一个实验组，接种细胞时按照行的顺序进行，从而将各类影响因素纳入系统误差。
3. 将接种好的细胞培养板放入培养箱中培养至合适细胞密度，加入合适的药物或其他干预。我们的经验，细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间，通常培养过夜即贴壁良好。因此，我们常在前一天下午铺板，次日上午加药，一般5-7个梯度，每孔100ul，设3~6个复孔，建议设6个。
4. 每孔加入10~20μl MTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4~6h。经验告诉我们，时间低于4h则反应不完全，超过6h则甲瓒开始逐渐于孔底脱离。若细胞干预的药物能够与MTT能够反应（强氧化性或强还原型的药品可能与MTT发生反应），则可先弃去培养液，小心用PBS洗2-3遍后，再加入含MTT的培养液，操作务必轻柔，避免直接吹打细胞面。
5. 终止培养，准备溶解结晶。吸弃上清液，每孔加入150ul DMSO，摇床中低速震荡10min使结晶充分溶解，摇床不宜过快或过慢，过慢结晶不能很好溶解，过快则液体易震荡出孔。冬季温度较低时，可于37摄氏度恒温摇床内震荡10~15分钟，再上机检测。
6. 酶联免疫检测仪分别于OD490nm和OD570nm处测量各孔的吸光值。
7. 在一定范围内，测量的吸光度值与细胞数目呈正相关。因此，细胞存活率公式可表示为：Survival rate = (ODtreatment group/ODcontrol group) × 100%。